Enfeksiyöz bursal hastalığına karşı aşılamada maternal kaynaklı antikorların etkisi

7 Mart 2019

Günlük yaştaki civcivlerdeki maternal antikor seviyesi hakkında bilgi sahibi olunması halinde, antikorun civcivlerde ne kadar süreyle kalacağı kolaylıkla hesaplanabilecek olup, Gumboro hastalığına karşı iyi bir aşılama programı hazırlanabilir.

Özet: Enfeksiyöz bursal hastalığı, kümes hayvanlarında görülen ve genellikle 3-6 haftalık genç tavukları etkileyen en önemli viral hastalıklardan biridir. Hijyen yönetimi ve uygun aşılama, bu hastalığın kontrol edilmesinin temel yoludur. Ancak, maternal antikorlar, canlı aşı uygulamalarını etkilemektedir. Maternal kaynaklı antikorların canlı aşı üzerindeki etkisini belirlemeye yönelik bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında, toplam 100 adet, günlük civcivler (50’si aşılanmış damızlık stoğundan, 50’si aşılanmamış damızlık stoğundan) kullanılmıştır. Tavuklar ile ilgili olarak, önceden belirlenmiş bir aşılama programı takip edilmiş olup, fiili etkinin tespit edilmesi amacıyla kan örnekleri alınmıştır. Bir günlük civcivlerin, 15-20 gün içerisinde (390.45 ±19.42), kademeli olarak, pozitif seviyenin altına düşen yüksek seviyeli (6294.14±24.95) maternal kaynaklı antikorlar içerdiği ve yarılanma süresinin yaklaşık 5 gün olduğu gözlemlenmektedir. Tavukların, yüksek seviyeli maternal kaynaklı antikorlar bulundurması, aşı virüsünü etkilemektedir; hiçbir immün yanıt ile sonuçlanmamakla birlikte, yeniden aşılama uygulaması, immün yanıtı teşvik etmektedir. 21 günlükken aşılanan ve 28 günlükken tekrar aşılanan civcivlerde daha iyi immün yanıt tespit edilmiştir. Ancak, maternal antikorların, 15-20 gün içerisinde pozitif seviyenin altına düşmesinden dolayı, enfeksiyon ihtimali olabilecektir. Aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerde, 7 günlükken gerçekleştirilen ilk birincil aşıdan ve 14 günlükken tekrarlanan aşıdan itibaren, muhtelif zamanlarda iyi immün yanıt görülmüştür.

Giriş
Bangladeş, hayvansal protein eksikliği yaşayan pek çok gelişmekte olan ülkeden biridir. Bu ülkede, hayvan başına ortalama et ve yumurta tüketimi, 120 g/gün ve 2.0/hafta ihtiyacına karşılık, sırasıyla, 2.51 g/gün ve 0.485/haftadır. Et ve yumurtalar, iki önemli hayvansal proteindir. Kümes hayvanları eti ve yumurtaları, ülkedeki toplam hayvansal protenin yaklaşık olarak %38’ini sağlamaktadır.

Kümes hayvanları sektörü, Bangladeş’te hızlı bir şekilde gelişmekte olan sektörlerden biri olup, %3 oranında gayri safi yurt içi hasıla ile milli ekonomiye katkıda bulunmaktadır. Günümüzde, çiftçiler, yoğun bakıma, gelişmiş yönetime ve kaliteli aşının uygun zamanlarda uygulanmasına bağlı olan, ithal et ve yumurta üreten tavuklar yetiştirmektedir. Broyler artışı, kümes hayvanları ticari girişiminin önemli bir kısmını teşkil etmekte olup, son zamanlarda, başlıca artan hayvansal protein talebi sağlamaktadır. Bugünlerde, kırsal topluluklar da düşük maliyet ile broyler yetiştiriciliği ile ilgilenmektedir. Ancak, ne yazık ki, çiftlikler, çeşitli bulaşıcı hastalık sorunlarıyla karşılaşmaktadır. Söz konusu bulaşıcı hastalıkların arasında, genç tavuklarda görülen enfeksiyöz bursal hastalığı (IBD), en önemli olanıdır. Bu hastalık, ilk olarak Delware, ABD’de Gumboro bölgesinde ortaya çıktığından dolayı, Gumboro olarak da bilinmektedir (Cosgrove, 1962).

Söz konusu hastalık, Mart 1992 tarihinden bu yana, Bangladeş’te, oldukça yüksek morbidite ve mortalite ile görülmektedir (Islam ve ark., 1994a; 1994b; Rahman, 1994).

Tavukların, canlı attenüe veya inaktif aşı virüsü ile aşılanması, söz konusu hastalığın kontrol edilmesinde en etkili yoldur. İndüklenen antikorlar, yumurta sarısı aracılığıyla civcivlere aktarılmakta olup, yumurtadan yeni çıkan civcivleri, kritik olan ilk birkaç hafta boyunca korumaktadır (Wyeth ve Cullen, 1976). Aşının aşırı bir şekilde kullanılmasına rağmen, çiftçiler, Gumboro sorunlarıyla karşılaşmaya devam etmektedirler.

Gerekliliği karşılamak amacıyla, Bangladeş’te, IBD’ye karşı çeşitli canlı ve inaktif aşılar ithal edilmektedir. Dünyada pek çok aşı şirketi bulunmakta olup, söz konusu şirketler, aşının kullanılması ile ilgili kendi spesifikasyonlarına sahiptir ve çiftçiler, civcivlerdeki maternal kaynaklı antikorların (MDA) durumu ve söz konusu antikorların canlı aşı uygulaması üzerindeki etkileri hakkında herhangi bir bilgiye sahip olmaksızın, bu aşıları, ticari kümes hayvanları çiftliklerinde, bir günlükten itibaren kullanmaktadır.

Yukarıdaki gerçekler göz önünde bulundurularak, hâlihazırdaki çalışma, aşağıdaki spesifik amaçlar doğrultusunda tasarlanmıştır.
– Aşılanmış ve aşılanmamış damızlık stoğundan (PS) gelen civcivlerde MDA’nın süresinin belirlenmesi.
– Broylerlerde Gumboroya karşı canlı aşı uygulamasının etkisi.

MATERYAL VE YÖNTEM
Deney civcivleri: Çalışma kapsamında, toplam 100 adet, günlük Arbor Acres ırkından olan civcivler (50’si aşılanmış damızlık stoğundan, 50’si aşılanmamış damızlık stoğundan) kullanılmıştır. Çalışma, Mart ve Nisan 2001 süresi boyunca, Bangladeş Çiftlik Hayvancılığı Araştırma Enstitüsü (BLRI) Kümes Hayvanları Yetiştirme Araştırma Bölümü ve Hayvan Sağlığı Araştırma Bölümü, Savar, Dhaka’da gerçekleştirilmiştir. Civcivler, tüm hijyenik önlemler sağlanarak, 6 hafta boyunca iyi havalandırılmış kümeslerde barındırılmıştır. Söz konusu civcivler, A ve B olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. A Grubu, 84 civcivden (aşılanmış damızlık stoğundan 42 civciv ve aşılanmamış damızlık stoğundan 42 civciv olmak üzere) B Grubu ise 16 civcivden (aşılanmış damızlık stoğundan 8 civciv ve aşılanmamış damızlık stoğundan 8 civciv olmak üzere) oluşmaktadır.

Tavukların aşılanması: A Grubunda bulunan civcivler, aşılamaya tabi tutulmuş olup, farklı yaşlarda aşı tekrarlanmıştır. B Grubunda bulunan civcivler, aşılanmamış kontrol grubu olarak kalmıştır. Bu grupta, civcivlerde maternal kaynaklı antikor kalıcılığı tespit edilmiştir. Aşılanmış damızlık stoğundan kırk iki civciv, her birinde 14 civciv bulunan üç alt gruba ayrılmıştır. Benzer şekilde, aşılanmamış damızlık stoğundan 42 civciv de üç alt gruba ayrılmıştır. Aşılanmış damızlık stoğundan gelen civcivlerin bulunduğu üç alt gruba, ilk olarak, sırasıyla, 7, 14 ve 21 günlükken aşılama yapılmıştır. İlk aşılama işleminden yedi gün sonra, civcivlerin yarısına tekrar dozu uygulanmıştır (her bir gruptaki 7 civciv uygulanan tekrar dozu). Aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivler için de benzer bir aşılama programı takip edilmiştir.

Aşılanmamış ve aşılanmış civcivlerden serumların alınması ve hazırlanması: 1, 5, 10, 15, 20 ve 25 günlükken, aşılanmamış kontrol grubu civcivlerinden kan örnekleri alınmıştır. 7, 14 ve 21 günlükken, A grubunun tüm alt grubunda bulunan civcivlerden ön aşılama serumları alınmıştır. Aşılama işleminin ve tekrar dozunun ardından 7 ve 14 günlükken aşı sonrası serumları alınmıştır. Serumlar, test edilinceye kadar, -20 °C’de muhafaza edilmiştir. Aşılama işlemi ile indüklenen MDA’yı ya da antikorları tespit etmek için ELISA kullanılmıştır.

ELISA’nın Uygulanması: Aşılanmamış ve aşılanmış civciv gruplarından, aşılama işlemi ile indüklenen MDA’nın ya da IBDV-spesifik antikorlarının tespiti için, tek dilüsyonluk (1:500) serumda ELISA uygulanmıştır.

UYGUN TEST
Numunenin hazırlanması: 1 µl’lik serum, ELISA kitinde temin edilen 500 µl’lik seyreltici (1:500) karıştırılmıştır. Karıştırılan numune, test numunesi olarak kullanılmıştır.

Tek dilüsyonluk serum kullanılarak gerçekleştirilen ELISA temel protokolü: Önceden IBDV antijenler ile kaplanmış 96 kuyucuklu bir plakada, A ve A2 sayılı kuyucuklar seçilerek, negatif kontrol serumu için kullanılırken, A3 ve A4 sayılı kuyucuklar, pozitif kontrol serumu için kullanılmıştır. Geriye kalan 92 kuyucuk, 46 numune (iki kuyucukta bir numune) için kullanılmıştır. 100 µl’lik negatif kontrol serumu ve 100 µl’lik pozitif kontrol serumu (dilüsyonsuz), sırasıyla, seçilen A1, A2 ve A3, A4 sayılı her bir kuyucuğa yerleştirilmiştir. Sonrasında, 100 µl’lik seyreltilmiş 46 test numunesi uygun kuyucuklara yerleştirilmiştir. Plaka, 30 dakika süresince oda sıcaklığında inkübe edilmiş, sonrasında, iyonsuzlaştırılmış distile su ile dört kez yıkanmıştır ve her seferinde, her bir kuyucuğa, 200 µl’ik iyonsuzlaştırılmış distile su eklenmiştir. Her bir kuyucuğa 100 µl’lik konjugat yerleştirilmiş ve söz konusu konjugat, 30 dakika süresince oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Plaka, iyonsuzlaştırılmış distile su ile dört kez yeniden yıkanmıştır ve her seferinde, her bir kuyucuğa, 200 µl’ik iyonsuzlaştırılmış distile su eklenmiştir. Her bir kuyucuğa 100 µl’lik konjugat’lik substrat eklenmiş olup, söz konusu substratlar, 15 dakika süresince muhafaza edilmiştir. Her bir kuyucuğa, 100 µl’lik kesme çözeltisi eklenmiştir. Okuma, 650 nm filtre kullanılarak, ELISA okuyucusu ile gerçekleştirilmiştir. Test numunelerinin geriye kalanı, aşağıdaki prosedür doğrultusunda test edilmiştir.

Sonuçların hesaplanması: IBDV’ye özgü antikorların varlığı veya yokluğu, pozitif kontrol ortalamasının bilinmediği A (650) değeri ile ilişkilendirilerek tespit edilmiştir. Pozitif kontrol, standartlaştırılmış olup, tavuk serumlarındaki IBD’ye özgü önemli antikor seviyelerini temsil etmektedir. Bilinmeyendeki rölatif antikor seviyesi, pozitif (S/P) orandaki numunenin hesaplanması ile tespit edilebilecektir.

Antikor titresinin hesaplanması için, ELISA kitinde temin edilen hesaplama denklemi kullanılmıştır.
a) Negatif Kontrol Ortalaması (MCX)

(Well A1(650) + Well A2(650)) / 2 = NCX

b) Pozitif Kontrol Ortalaması (PCX)

(Well A3(650) + Well A4(650)) / 2 = PCX

c) S/P Rasyonu 
(Numune ortalaması – NCX) / (PCX – NCX)

d) Sonra titre noktasına yönelik 1:500 seyrelticide S/P’ye İlişkin Titre:
Kayıt10 Titre = 1.09 (Kayıt0 S/P) + 3.36

Sonuçların yorumlanması: 0.2’den daha az veya 0.2’ye eşit S/P oranlarına sahip serum numuneleri negatif olarak ele alınmalıdır. 0.2’den fazla S/P oranına sahip (396’dan büyük titreler) serum numuneleri ise, pozitif olarak ele alınmalıdır ve aşılama işlemini veya IBDV’ye maruz kalındığını göstermektedir.

SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Aşılanmış ve aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerde MDA varlığı: Maternal kaynaklı antikorların varlığını tespit etmek için, 1, 5, 10, 15, 20 ve 25 günlük civcivlerden kan örnekleri alınmıştır. Tüm numuneler/örnekler, ELISA kullanılarak test edilmiştir. ELISA testinin sonuçları, (Tablo 1’de) verilmiştir.

Tablo 1 doğrultusunda, aşılanmış damızlık stoğundan gelen civcivler, 1 günlükken, 6294.14±24.95 (4701.51-8481.41) olmak üzere yüksek seviyeli MDA içermekle birlikte, aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerde, düşük maternal antikorlar görülmüştür. Diğer yazarlar tarafından da benzer bir sonuç gözlemlenmiştir. Cao Yong Chang ve ark. (1995), ELISA kullanarak, IBDV’nin immünolojik etkisini değerlendirmiş ve MDA seviyesinin, 1 günlükken yüksek olduğunu tespit etmiştir. Malay Mitra ve ark. (1998), MDA seviyesinin, 1 günlük civcivlere kıyasla, 12 günlük civcivlerde, önemli derecede düşük olduğunu tespit etmiştir. ELISA antikor test kiti üreten şirkete (IDEXX-ABD) göre, 0.2’den az olan veya 0.2’ye eşit olan S/P oranı, olumsuz olarak değerlendirilmeli ve 0.2’den fazla olan (396 titre) S/P oranı ise, olumlu antikor olarak değerlendirilmelidir. Yumurtlamanın ardından, antikor titresi, 15-20 gün içerisinde, giderek, pozitif seviyenin altına düşmüştür (390.45 ±19.42). Söz konusu düşüşün oranı, yaklaşık olarak, 5 günde bir yarılanmıştır. Bu iki bulgu, bazı yazarlar tarafından tespit edilen bulgular ile eşleşmiş olup, bazı yazarların bulguları ile eşleşmemiştir.

Azab ve ark. (1991), iki egzotik ve yerel broyler civciv grubunda, IBD’ye karşı maternal antikorların tespit edilmesine yönelik bir araştırma gerçekleştirmiştir. Maternal antikorların, yumurtlamadan sonra, egzotik ve yerel tavuklarda, sırasıyla, 18 gün ve 14 gün süreyle devam ettiğini tespit etmişlerdir. MDA, yumurtlamadan sonra, 11-19 güne kadar bazen de 23 gün süreyle devam etmiştir (VWsniewska ve Stosik,1999). Hitchner (1971); Wfyeth ve Cullen (1979); lord an ides ef al. (1991); Yehuda ef al. (2000), maternal antikorların, yumurtlamadan sonra, sırasıyla, 28, 29, 30 ve 20 gün devam ettiğini tespit etmişlerdir. Tsai-Hsiang Jung ve ark. (1995), ELISA maternal antikorların yarılanma süresinin, 4.2-9.2 gün aralığında olduğunu belirtmiştir. Civcivlerde, MDA’dan IBD’ye yarılanma süresi, 3.46 gün şeklinde gerçekleşmiştir (Saijo ve Higashihara, 1998). Bu değişikliğinin sebebi, damızlık stoğuna yönelik olarak farklı aşı türlerinin ve aşılama programlarının kullanılması olabilecektir.

Aşılanmış damızlık stoğundan gelen civcivlerde, maternal kaynaklı antikorların ve canlı aşıların etkileşimi: Aşılanmış damızlık stoğundan gelen civcivlerin bulunduğu üç alt gruba, ilk olarak, sırasıyla, 7, 14 ve 21 günlükken aşılama yapılmıştır. İlk aşılama işleminden yedi gün sonra, her bir alt grup, iki ikincil alt gruba daha ayrılmıştır. Her bir alt grubun bir ikincil alt grubu, söz konusu günde tekrar aşılama işlemine tabi tutulurken, her bir alt grubun diğer ikincil alt grubu, tekrar dozuna tabi olmamıştır. İlk aşılama işleminden önce ve ilk aşılama ve tekrar dozundan 7 ve 14 gün sonra, her bir ikincil alt gruptan numune alınmıştır. Tüm serumlar, ELISA kullanılarak test edilmiştir. Sonuçlar, Tablo 2, 3 ve 4’te verilmiştir.

Tablo 2’de, ilk aşılama işleminden önce, antikorların (maternal), yüksek olduğu, ancak, aşılama işleminden sonra, antikor titresinin düştüğü gözlemlenmektedir. Tablo 2 kapsamında, maternal antikorların, canlı aşı virüsü ile tepkimeye girerek nötr hale gelmesinden veya maternal kaynaklı antikorların etkileşiminden dolayı, söz konusu aşının, bağışıklık sistemini uyaramadığı görülmektedir. Bu yüzden, herhangi bir bağışıklık tepkisi bulunmamaktadır. Ancak, 14 günlükken uygulanan tekrar dozundan sonra, bağışıklık tepkisi görülmekte ve antikor titresi giderek artmaktadır. IBDV’ye karşı yüksek seviyede MDA’ya sahip olan günlük civcivlerin aşılanmasının, ilk başta bağışıklık tepkisi veremediğini belirten Knezevic ve ark. (1999) tarafından da benzer sonuçlar gözlemlenmiştir. Ancak, yeniden aşılama, geciken ilk bağışıklık tepkisini harekete geçirmiştir.

Tablo 3’te, 14 günlükken aşılanan civcivlerin, ilk bağışıklık tepkisi gösterdiği, ancak, tekrar dozundan sonra, antikor titresinin, çok yüksek olmadığı ve ikincil bağışıklık tepkisinin gerçekleştiği ve de titrenin arttığı görülmektedir. Ayrıca, burada da aynı reaksiyon bulunmaktadır. Tablo 4’te ise, en iyi bağışıklık tepkisinin, ilk olarak 21 günlükken aşılanan ve 28 günlükken tekrar dozu uygulanan civcivlerde görüldüğü gözlemlenmektedir. İlk aşılama işleminin ardından antikor titresi, diğer gruplardaki civcivlere kıyasla, bu gruptaki civcivlerde, nispeten daha yüksektir. En düşük antikor titresinin, 7 günlükken aşılanan civcivlerde görüldüğü tespit edilmiştir. En iyi bağışıklık tepkisinin, 21 günlükken aşılanan ve 7 gün sonra tekrar dozu uygulanan alt grupta tespit edilmiş olmasına rağmen, maternal antikor titresinin, yumurtlamadan sonra 15-20 gün içerisinde pozitif seviyenin altına düşmesinden dolayı, bu gruptaki civcivlere, 21 günden önce IBDV’nin bulaşması olasılığı olabilecektir. Dolayısıyla, aşının 21 günlükken uygulanması halinde, antikor üretilmesi 5-7 gün sürecek olup, tavuklar, en az 7-10 gün süreyle risk altında olacaktır. Çünkü bu çalışmaya göre, maternal antikorlar, yumurtlamadan sonra 17 günlükken pozitif seviyenin altına düşmüştür.

IBD’ye karşı herhangi bir aşı geçmişi olmayan damızlık stoğundan gelen civcivler: Aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerin bulunduğu alt grupların sonuçları da Tablo 2, 3 ve 4’te verilmiştir. Bu durumda, aksi reaksiyon görülmüştür. Tablo 2’de, IBDV’ye karşı MDA bulunmayan civcivlerin aşılanmasının, ilk bağışıklık tepkisi gösterdiği ve tekrar dozunun ardından, antikor seviyesinin arttığı görülmektedir.

Tablo 3’te, 14 günlükken aşılanan civcivlerin, ilk bağışıklık tepkisi gösterdiği ve tekrar dozundan sonra, antikor titresinin, önceki gruptan yüksek olduğu ve ikincil bağışıklık tepkisinin gerçekleştiği ve de titrenin arttığı görülmektedir. Tablo 4’te ise, en iyi bağışıklık tepkisinin, 21 günlükken aşılanan ve 28 günlükken tekrar dozu uygulanan civcivlerde görüldüğü gözlemlenmektedir.

Broylerlerde Gumboro’ya karşı canlı aşı ile aşılama gerçekleştirilmesinde MDA’nın etkisi, Tablo 2, 3 ve 4’te açık bir şekilde görülmektedir. Bu tablolarda, aynı aşının, aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerdeki sonuçları ile kıyaslandığında, MDA’ya sahip olan tavukların, canlı aşı ile aşılanmaya tepki göstermediği gözlemlenmektedir.

Çünkü civcivlerin aşılanma zamanı, MDA derecesine bağlıdır (Voss ve Vielitz, 1994). Üç ayrı gruptaki ilk bağışıklık tepkileri, aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerdeki tepkiler ile aynı değildir. Tekrar dozuna gösterilen tepki, gerek aşılanmış gerek aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerde iyi olarak gözlemlenmiştir. Gerek aşılanmış gerek aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerde 14 günlükken uygulanan aşılama ve 7 gün sonra uygulanan tekrar dozu, benzer serokonversiyon göstermiştir. 21 günlükken aşılanan ve 28 günlükken tekrar dozu uygulanan civcivlerdeki antikor seviyesi, gerek aşılanmış gerek aşılanmamış damızlık stoğundan gelen civcivlerde daha yüksektir.

SONUÇ 
Bu çalışma sonucunda, maternal kaynaklı antikorların, yumurtlamadan sonra, civcivlerde, 15-20 güne kadar devam ettiği, ancak, bu hususun, civcivlerin geldiği damızlık stoğunun antikor durumuna bağlı olduğu görülmüştür. Söz konusu antikorların yarılanma süresi yaklaşık olarak 5 gündür. Dolayısıyla, günlük yaştaki civcivlerdeki maternal antikor seviyesi hakkında bilgi sahibi olunması halinde, antikorun, civcivlerde ne kadar süreyle kalacağını kolaylıkla hesaplanabilecek olup, enfeksiyöz bursal hastalığına karşı, iyi bir aşılamam programı hazırlanabilecektir. Maternal kaynaklı antikor durumu hakkında bilgi sahibi olunmaksızın, günlük ve daha sonrasındaki yaşlarda civcivlerin aşılanması sonucu ortaya çıkan, yanlış aşı kullanımları kontrol edilebilecektir.

• Paylaş